Nọc rắn chứa enzym thủy phân các liên kết cacboxyl este.Cơ chất cho quá trình thủy phân là phospholipid, acetylcholine và axetat thơm.Những enzyme này bao gồm ba loại: phospholipase, acetylcholinesterase và esterase thơm.Arginine esterase trong nọc rắn cũng có thể thủy phân arginine hoặc lysine tổng hợp, nhưng nó chủ yếu thủy phân các liên kết peptide protein trong tự nhiên, vì vậy nó thuộc về protease.Các enzym được thảo luận ở đây chỉ hoạt động trên cơ chất este và không thể hoạt động trên bất kỳ liên kết peptit nào.Trong số các enzym này, chức năng sinh học của acetylcholinesterase và phospholipase quan trọng hơn và đã được nghiên cứu đầy đủ.Một số nọc rắn có hoạt tính esteraza thơm mạnh, có thể thủy phân p-nitrophenyl etyl este, a – hoặc P-naphthalene axetat và indole etyl este.Vẫn chưa biết liệu hoạt động này được tạo ra bởi một enzyme độc lập hay tác dụng phụ đã biết của carboxylesterase, chứ chưa nói đến ý nghĩa sinh học của nó.Khi nọc độc của Agkistrodon halys Japonicus được phản ứng với p-nitrophenyl ethyl ester và indole ethyl ester, không tìm thấy sản phẩm thủy phân của p-nitrophenol và indole phenol;Ngược lại, nếu các este này phản ứng với nọc rắn hổ mang phân loài Zhoushan và nọc rắn Bungarus multicinctus, chúng sẽ nhanh chóng bị thủy phân.Được biết, nọc rắn hổ mang này có hoạt tính cholinesterase mạnh, có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng thủy phân các cơ chất trên.Trên thực tế, Mclean et al.(1971) cho biết nhiều nọc rắn thuộc họ Rắn hổ mang có thể thủy phân indole ethyl ester, naphthalene ethyl ester và butyl naphthalene ester.Nọc rắn này đến từ: rắn hổ mang, rắn hổ mang cổ đen, rắn hổ mang môi đen, rắn hổ mang vàng, rắn hổ mang Ai Cập, rắn hổ mang chúa, rắn hổ mang vàng mamba, mamba đen và mamba môi trắng (D. aw vẫn biết rắn đuôi chuông rhombola phía đông
Nọc rắn có thể thủy phân methyl indole ethyl ester, là cơ chất để xác định hoạt tính cholinesterase trong huyết thanh, nhưng nọc rắn này không thể hiện hoạt tính cholinesterase.Điều này cho thấy trong nọc rắn hổ mang có một loại esterase chưa biết, khác với cholinesterase.Để hiểu được bản chất của enzym này, cần tiến hành phân tách thêm.
1、Phospholipaza A2
(I) Tổng quan
Phospholipase là một loại enzyme có thể thủy phân glyceryl phosphate.Trong tự nhiên có 5 loại phospholipase là phospholipase A2 và phospholipase
A. , phospholipase B, phospholipase C và phospholipase D. Nọc rắn chủ yếu chứa phospholipase A2 (PLA2), một số nọc rắn chứa phospholipase B và các phospholipase khác chủ yếu được tìm thấy trong mô động vật và vi khuẩn.Hình 3-11-4 cho thấy vị trí hoạt động của các phospholipase này trong quá trình thủy phân cơ chất.
Trong số các phospholipase, PLA2 được nghiên cứu nhiều hơn.Nó có thể là enzyme được nghiên cứu nhiều nhất trong nọc rắn.Cơ chất của nó là liên kết este ở vị trí thứ hai của Sn-3-glycerophosphate.Enzyme này được tìm thấy rộng rãi trong nọc rắn, nọc ong, nọc bọ cạp và các mô động vật, và PLA2 có nhiều trong bốn loại nọc rắn thuộc họ.Vì enzym này phá vỡ các tế bào hồng cầu và gây tán huyết, nên nó còn được gọi là “hemolysin”.Một số người còn gọi lecithinase tan huyết PLA2.
Ludeeke lần đầu tiên phát hiện ra rằng nọc rắn có thể tạo ra một hợp chất tan máu bằng cách tác động lên lecithin thông qua các enzym.Sau đó, Delezenne et al.đã chứng minh rằng khi nọc rắn hổ mang tác dụng với huyết thanh hoặc lòng đỏ ngựa sẽ tạo thành chất gây tan máu.Hiện nay người ta biết rằng PLA2 có thể tác động trực tiếp lên phospholipid của màng hồng cầu, phá hủy cấu trúc của màng hồng cầu và gây tán huyết trực tiếp;Nó cũng có thể tác động lên huyết thanh hoặc lecithin được thêm vào để tạo ra lecithin tán huyết, tác động lên các tế bào hồng cầu để tạo ra tán huyết gián tiếp.Mặc dù PLA2 có nhiều trong bốn họ nọc rắn, nhưng hàm lượng enzyme trong các loại nọc rắn khác nhau hơi khác nhau.Rắn đuôi chuông (C
Nọc rắn chỉ thể hiện hoạt tính PLA2 yếu.Bảng 3-11-11 minh họa so sánh hoạt tính PLA2 của 10 loại nọc chính của các loài rắn độc ở Trung Quốc.
Bảng 3-11-11 So sánh hoạt tính phospholipase VIII của 10 loại nọc rắn ở Trung Quốc
nọc rắn
giải phóng chất béo
axit aliphatic,
Cujumol/mg)
Hoạt tính tán huyết CHU50/^ g * ml)
nọc rắn
Giải phóng axit béo
(^raol/mg)
Hoạt tính tán huyết “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
mười một
Micracephal ophis
năm điểm một không
kalyspallas
8. 68
hai nghìn tám trăm
gracilis
V, sắc bén
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
ba phẩy tám hai
một trăm bốn mươi
Bnugarus fasctatus
7,56
hai trăm tám mươi
B. đa sắc tố
một điểm chín sáu
hai trăm tám mươi
Viper một russelli
bảy điểm không ba
T, niêm mạc
một phẩy tám năm
Xiêm La
T. stejnegeri
0. 97
（2） Tách và làm sạch
Hàm lượng PLA2 trong nọc rắn lớn, bền với nhiệt, axit, kiềm và chất biến tính nên dễ dàng tinh chế và tách PLA2.Phương pháp phổ biến là trước tiên tiến hành lọc gel trên nọc thô, sau đó tiến hành sắc ký trao đổi ion và bước tiếp theo có thể được lặp lại.Cần lưu ý rằng quá trình đông khô của PLA2 sau sắc ký trao đổi ion không được gây ra sự kết tụ, vì quá trình đông khô thường làm tăng cường độ ion trong hệ thống, đây là một yếu tố quan trọng gây ra sự kết tụ của PLA2.Ngoài các phương pháp chung trên, các phương pháp sau đây cũng đã được áp dụng: ① Wells et al.② Chất tương tự cơ chất của PLA2 được sử dụng làm phối tử cho sắc ký ái lực.Phối tử này có thể liên kết với PLA2 trong nọc rắn bằng Ca2+.EDTA chủ yếu được sử dụng làm chất rửa giải.Sau khi Ca2+ bị loại bỏ, ái lực giữa PLA2 và phối tử giảm xuống và nó có thể bị phân ly khỏi phối tử.Những người khác sử dụng dung dịch hữu cơ 30% hoặc urê 6mol/L làm chất rửa giải.③ Sắc ký kỵ nước được thực hiện với PheiiylSephar0SeCL-4B để loại bỏ dấu vết PLA2 trong độc tố tim.④ Kháng thể kháng PLA2 được sử dụng làm phối tử để thực hiện sắc ký ái lực trên PLA2.
Cho đến nay, một số lượng lớn PLAZ nọc rắn đã được tinh sạch.Tú và cộng sự.(1977) đã liệt kê PLA2 được tinh chế từ nọc rắn trước năm 1975. Trong những năm gần đây, một số lượng lớn các bài báo về việc tách và tinh chế PLA2 đã được báo cáo hàng năm.Ở đây, chúng tôi tập trung vào việc phân tách và thanh lọc PLA của các học giả Trung Quốc.
Chen Yuancong và cộng sự.(1981) đã tách ba loài PLA2 từ nọc độc của Agkistrodon halys Pallas ở Chiết Giang, có thể được chia thành PLA2 có tính axit, trung tính và kiềm theo các điểm đẳng điện của chúng.Theo độc tính của nó, PLA2 trung tính độc hơn, được xác định là chất độc thần kinh Agkistrodotoxin trước synap.PLA2 kiềm ít độc hơn và PLA2 axit hầu như không có độc tính.Wu Xiangfu et al.(1984) đã so sánh các đặc điểm của ba PLA2, bao gồm trọng lượng phân tử, thành phần axit amin, đầu N, điểm đẳng điện, độ ổn định nhiệt, hoạt tính enzym, độc tính và hoạt tính tán huyết.Kết quả cho thấy chúng có trọng lượng phân tử và độ ổn định nhiệt tương tự nhau, nhưng có sự khác biệt đáng kể ở các khía cạnh khác.Về mặt hoạt động của enzyme, hoạt tính của enzyme axit cao hơn hoạt tính của enzyme kiềm;Tác dụng tán huyết của enzym kiềm đối với hồng cầu chuột là mạnh nhất, kế đến là enzym trung tính và enzym acid hầu như không gây tán huyết.Do đó, người ta suy đoán rằng tác dụng tán huyết của PLAZ có liên quan đến điện tích của phân tử PLA2.Zhang Jingkang và cộng sự.(1981) đã tạo ra các tinh thể Agkistrodotoxin.Tu Guanliang et al.(1983) đã báo cáo rằng một PLA độc với điểm đẳng điện là 7. 6 đã được phân lập và tinh chế từ nọc độc của Vipera rotundus từ Phúc Kiến, và các tính chất vật lý và hóa học, thành phần axit amin và trình tự của 22 gốc axit amin ở N -thiết bị đầu cuối đã được xác định.Li Yuesheng và cộng sự.(1985) đã phân lập và tinh chế một PLA2 khác từ nọc độc của Viper rotundus ở Phúc Kiến.Tiểu đơn vị của PLA2 * là 13 800, điểm đẳng điện là 10,4 và hoạt động cụ thể là 35/xnioI/miri mg。 Với chất nền là lecithin, độ pH tối ưu của enzyme là 8,0 và nhiệt độ tối ưu là 65 ° C LD5 tiêm tĩnh mạch ở chuột.Nó là 0,5 ± 0,12mg/kg.Enzyme này có tác dụng chống đông máu và tán huyết rõ ràng.Phân tử PLA2 độc hại bao gồm 123 dư lượng của 18 loại axit amin.Phân tử này rất giàu cysteine (14), axit aspartic (14) và glycine (12), nhưng chỉ chứa một methionine và đầu N của nó là gốc serine.So với PLA2 do Tuguang phân lập, trọng lượng phân tử và số lượng dư lượng axit amin của hai isoenzyme rất giống nhau, và thành phần axit amin cũng rất giống nhau, nhưng số lượng axit aspartic và dư lượng proline có phần khác nhau.Nọc độc của rắn hổ mang chúa Quảng Tây chứa PLA2 phong phú.Shu Yuyan et al.(1989) đã phân lập được PLA2 từ nọc độc, có hoạt tính đặc hiệu cao gấp 3,6 lần nọc độc ban đầu, trọng lượng phân tử 13000, thành phần gồm 122 gốc axit amin, điểm đẳng điện 8,9 và ổn định nhiệt tốt.Từ quan sát bằng kính hiển vi điện tử về tác dụng của PLA2 cơ bản đối với hồng cầu, có thể thấy rằng nó có tác dụng rõ ràng đối với màng tế bào hồng cầu của con người, nhưng không có tác dụng rõ ràng đối với tế bào hồng cầu của dê.PLA2 này có tác dụng làm chậm rõ rệt đối với tốc độ điện di của tế bào hồng cầu ở người, dê, thỏ và chuột lang.Chen và cộng sự.Enzyme này có thể ức chế sự kết tập tiểu cầu do ADP, collagen và natri arachidonic acid gây ra.Khi nồng độ PLA2 là 10/xg/ml~lOOjug/ml, sự kết tập tiểu cầu bị ức chế hoàn toàn.Nếu sử dụng tiểu cầu đã rửa sạch làm nguyên liệu thì PLA2 không thể ức chế sự kết tụ ở nồng độ 20Mg/ml.Aspirin là chất ức chế cyclooxygenase, có thể ức chế tác dụng của PLA2 trên tiểu cầu.PLA2 có thể ức chế kết tập tiểu cầu bằng cách thủy phân axit arachidonic để tổng hợp thromboxane A2.Cấu trúc dung dịch của PLA2 được sản xuất bởi nọc độc Agkistrodon halys Pallas ở tỉnh Chiết Giang đã được nghiên cứu bằng phương pháp lưỡng sắc tròn, huỳnh quang và hấp thụ tia cực tím.Kết quả thí nghiệm cho thấy cấu trúc chuỗi chính của enzym này tương tự như cấu trúc của enzym cùng loại từ các loài và chi khác, cấu trúc khung chịu nhiệt tốt, sự biến đổi cấu trúc trong môi trường axit là thuận nghịch.Sự kết hợp giữa chất hoạt hóa Ca2+ và enzyme không ảnh hưởng đến môi trường tồn dư tryptophan, trong khi chất ức chế Zn2+ thì ngược lại.Cách mà giá trị pH của dung dịch ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme khác với các thuốc thử trên.
Trong quá trình tinh chế PLA2 nọc rắn, một hiện tượng rõ ràng là nọc rắn chứa hai hoặc nhiều đỉnh rửa giải PLA2.Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: ① do sự tồn tại của các isozyme;② Một loại PLA2 được polyme hóa thành nhiều hỗn hợp PLA2 có trọng lượng phân tử khác nhau, hầu hết nằm trong khoảng 9 000~40 000;③ Sự kết hợp giữa PLA2 và các thành phần nọc rắn khác làm phức tạp PLA2;④ Do liên kết amit trong PLA2 bị thủy phân nên điện tích thay đổi.① Và ② là phổ biến, chỉ có một số ngoại lệ, chẳng hạn như PLA2 trong nọc rắn CrWa/w
Có hai trường hợp: ① và ②.Tình trạng thứ ba đã được tìm thấy trong PLA2 trong nọc độc của các loài rắn sau: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, rắn lục Palestine, rắn lục cát và rắn đuôi chuông khủng khiếp km。
Kết quả của trường hợp ④ làm cho tốc độ di chuyển của PLA2 thay đổi trong quá trình điện di, nhưng thành phần axit amin không thay đổi.Peptide có thể bị phá vỡ bằng cách thủy phân, nhưng nhìn chung chúng vẫn liên kết với nhau bằng liên kết disulfide.Nọc độc của rắn đuôi chuông hố phía đông chứa hai dạng PLA2, được gọi là PLA2 loại a và loại p tương ứng.Sự khác biệt giữa hai loại PLA2 này chỉ là một axit amin, nghĩa là glutamine trong một phân tử PLA2 được thay thế bằng axit glutamic trong phân tử PLA2 khác.Mặc dù lý do chính xác cho sự khác biệt này là không rõ ràng, nhưng người ta thường tin rằng nó có liên quan đến quá trình khử amin của PLA2.Nếu PLA2 trong nọc rắn lục Palestine được giữ ấm bằng nọc thô, thì các nhóm kết thúc trong các phân tử enzyme của nó sẽ trở nên nhiều hơn trước.Từ C PLA2 được phân lập từ nọc rắn có hai đầu N khác nhau và trọng lượng phân tử của nó là 30000. Hiện tượng này có thể do dimer không đối xứng của PLA2 gây ra, tương tự như dimer đối xứng được hình thành bởi PLA2 trong nọc độc của rắn đuôi chuông lưng kim cương phía đông và rắn đuôi chuông kim cương phía tây.Rắn hổ mang châu Á bao gồm nhiều phân loài, một số phân loài không được phân loại rõ ràng.Ví dụ, những gì từng được gọi là phân loài Cobra Outer Caspi hiện đã được công nhận
Nó nên được quy cho Rắn hổ mang biển Caspi bên ngoài.Do có nhiều phân loài và chúng được trộn lẫn với nhau nên thành phần của nọc rắn rất khác nhau do các nguồn khác nhau và hàm lượng các isozyme PLA2 cũng cao.Ví dụ, nọc rắn hổ mang
Ít nhất 9 loại PLA2 isozyme của r^ll loài đã được tìm thấy trong, và 7 loại PLA2 isozyme đã được tìm thấy trong nọc độc của phân loài rắn hổ mang Caspian.Dukin et al.(1981) nghiên cứu hàm lượng PLA2 và số lượng isozyme trong các loại nọc rắn khác nhau, gồm 18 nọc rắn hổ mang, 3 nọc rắn mamba, 5 nọc rắn lục, 16 nọc rắn đuôi chuông và 3 nọc rắn biển.Nhìn chung, hoạt tính PLA2 của nọc rắn hổ mang cao, có nhiều isozyme.Hoạt tính PLA2 và isozyme của nọc độc viper ở mức trung bình.Hoạt tính PLA2 của nọc rắn mamba và nọc rắn đuôi chuông rất thấp hoặc không có hoạt tính PLA2.Hoạt tính PLA2 của nọc rắn biển cũng thấp.
Trong những năm gần đây, không có báo cáo nào cho thấy PLA2 trong nọc rắn tồn tại ở dạng dimer hoạt động, chẳng hạn như rắn đuôi chuông rhombophora phía đông (nọc rắn C. chứa PLA2 loại a và loại P, cả hai đều bao gồm hai tiểu đơn vị giống hệt nhau , và chỉ dimerase có
Hoạt động.Shen và cộng sự.cũng đề xuất rằng chỉ dimer PLA2 của nọc rắn là dạng hoạt động của enzyme.Nghiên cứu về cấu trúc không gian cũng chứng minh PLA2 của rắn đuôi chuông lưng kim cương phương Tây tồn tại ở dạng mờ hơn.hợp chất ăn cá
Có hai PLA^Ei và E2 khác nhau của nọc rắn, trong đó 仏 tồn tại ở dạng dimer, dimer hoạt động và monome phân ly của nó không hoạt động.Lu Yinghua et al.(1980) tiếp tục nghiên cứu các tính chất vật lý và hóa học và động học phản ứng của E. Jayanthi et al.(1989) đã phân lập PLA2 cơ bản (VRVPL-V) từ nọc rắn lục.Trọng lượng phân tử của monome PLA2 là 10000, có tác dụng gây chết người, chống đông máu và phù nề.Enzyme có thể trùng hợp các polyme có trọng lượng phân tử khác nhau trong điều kiện PH 4,8, và mức độ trùng hợp và trọng lượng phân tử của polyme tăng lên khi nhiệt độ tăng.Trọng lượng phân tử của polyme được tạo ra ở 96 ° C là 53 100 và hoạt tính PLA2 của polyme này tăng gấp đôi
Thời gian đăng bài: 18-Nov-2022